新冠病毒测试背后的科学

香港科技大学化学系理学教育助理教授陈钧杰教授

新型冠状病毒肺炎全球大流行之际，香港疫情的再度爆发令我们忧心忡忡。新冠病毒测试能够辨认出受感染的人士，有助尽早安排隔离和治疗。因此，病毒测试对阻截病毒传播至关重要。这篇文章将为大家介绍新冠病毒测试背后的科学。

在新冠病毒测试中，深喉唾液样本会被送往实验室进行检测。而新冠病毒检测应用到一个名为“单步逆转录—实时聚合酶链式反应”(One-step Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR)的技术。为更好地了解病毒测试的原理，这篇文章将为大家逐步剖析。

1. 逆转录---把病毒基因密码翻译成DNA

众所周知，我们的遗传密码都记录在DNA (deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸)中，而DNA “密码”则由四个“字母”---- “A”, “T”, “C”和 “G”排列而成。在化学上，A、T、C、G 属于一类名为 “碱基”的化学物，而DNA则是由它们组成的聚合物。A、T、C、G不同的排列对应着不同的氨基酸序列。由于我们身体里的蛋白质由氨基酸组成，A、T、C、G不同的排列控制了我们身体里蛋白质的制造，也控制了我们身体的运作。

当我们的身体制造蛋白质时，它会先把DNA密码进行翻译。一般而言，我们的细胞会把DNA翻译RNA(ribonucleic acid, 核糖核酸)。因为这个以RNA 写成的翻译版本会被用作传达基因信息，所以它被称为 “信使RNA”(messenger RNA, mRNA)。这个由DNA翻译成mRNA 的过程称为转录 (transcription)。

核糖核酸病毒 (RNA virus) 的基因密码记录在RNA，而不是DNA。有些RNA病毒能直接将它们的RNA基因在人类细胞中当作mRNA入侵我们的细胞 （例如新冠病毒），亦有些RNA病毒 (例如艾滋病病毒) 会先将它们的RNA遗传基因密码翻译成DNA的格式，这样病毒就可以把它们的基因插入我们的基因之中，伪装为我们自身的基因。

病毒这样做的最终目的就是利用我们的细胞去复制自身。病毒把RNA记录的遗传密码转换为DNA的过程与转录恰恰相反，所以它被称为逆转录 (reverse transcription)。核糖核酸病毒有一种名为逆转录酶(reverse transcriptase)的酵素，以加快逆转录的速度。而逆转录所得的DNA因为与病毒的RNA相互对应，所以被称为互补DNA(complementary DNA, cDNA)。因为互补DNA记录了病毒的基因密码，所以它将会对往后的步骤十分重要。

2. 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应能够把一段DNA 序列复制数以百万次。这令科学家能够取得足够的DNA样本来进行测试。例如在新冠病毒测试中，聚合酶链式反应有助取得足够份量的DNA，以证实当中是否有病毒的基因序列。

聚合酶链式反应是一个化学反应，而它需要下列材料:

• 测试者的DNA 样本 (作为复制的模板)
• 一种耐热的DNA聚合酶 （作为一种能复制DNA 的酵素）
• 一对名为引物的DNA序列 (用作标记复制的范围)
• 碱基 (DNA 的组成部分)
• 镁盐 (因为DNA聚合酶需要镁离子才能正常运作)
• 缓冲溶液 (把酸碱值维持在一个适当水平)

以上材料在塑料管混合以后，会被放在温度循环器中。在温度循环器中，温度会在95度 (3 秒) 和55度(30秒) 之间来回循环。

在95度中，DNA 的双链结构会被打开，变为各自一段单链。这一步称为变性。

然后，温度下降至55度。一对对应新冠病毒基因的引物会尝试寻找新冠病毒的基因序列。如果测试者带有新冠病毒，这对引物就会找到相应的序列。这一步名为退火。一旦引物找到属于病毒的基因序列，DNA 聚合酶就会开始复制病毒留下的基因序列。这一步称为延长。在这一步之后，我们便成功把DNA复制了一遍。

在下一个温度循环时，温度回升至95度。在那时，延长会停止。而DNA的双链结构会再被打开。然后所有步骤再重复一次。

如此类推，DNA的份量在每次循环中会增加两倍。在45个循环后，我们所获得的DNA是原来的2⁴⁵ 倍。

图表展示了病毒筛查背后所涉及的化学反应。另外注意UNG 处理这一步的目的在于减少不同测试样本之间的交叉污染。(美国疾病控制与预防中心 --- 病毒检测指南)

3. 实时聚合酶链式反应 / 定量实时聚合酶链式反应

聚合酶链式反应对测试人员构成不便的主因是，在这类常用的方法中，科学家必须要等候完成所有循环才能进行最终测试并得知结果。于是，科学家加以改良，令他们能够实时监察测试的进度。经改良后的方法称为实时聚合酶链式反应或定量实时聚合酶链式反应。在这个新方法中，科学家把原来的引物换成了DNA 探针，而DNA 探针的功能亦是寻找测试样本中的病毒基因。DNA 探针有两种特征: 它的一端带有荧光染料，而另一端则带有荧光淬灭剂。当DNA 探针同时带有荧光染料和荧光淬灭剂，荧光淬灭剂会阻止荧光染料发光。

*在新冠病毒测试中用到的前置引物、后置引物和DNA 探针 (美国疾病控制与预防中心 --- 病毒检测指南)

在退火的那一步中，DNA 探针会在样本的DNA中寻找对应的序列。而在其后的步骤中，DNA 聚合酶会到达DNA 探针所在的位置，并开始复制DNA。在那时，DNA 聚合酶会把DNA 探针上的荧光染料释放出来。因此，荧光染料得以发光，而我们可以在紫外光下接收荧光讯号。我们便可以透过量度荧光讯号的强度，得知测试的进度。

*示意图展示了DNA 探针的运作原理。蓝色圆形 = 荧光染料; 红色圆形 = 荧光淬灭剂; 黄色 = DNA 聚合酶

4. 单步逆转录—实时聚合酶链式反应

疑似患者的深喉唾液样本有可能带有新冠病毒，而单步逆转录—聚合酶链式反应可以有助我们确认谁是真正患者。

第一步是透过逆转录，将病毒的RNA转换成相应的互补DNA序列。而互补DNA序列将会在下一步的聚合酶链式反应派上用场。

在传统的做法中，我们需要透过逆转录取得互补DNA，然后对互补DNA进行聚合酶链式反应。这涉及两个步骤，既繁复又费时。因此，科学家将工序改良，把原本需要两步的反应简化为一步。这样把测试效率大大提高，而温度的调节可以控制逆转录和聚合酶链式反应的进度。

*单步与双步逆转录—聚合酶链式反应之间的比较

如果荧光讯号的强度超过特定门坎，那个样本即是对测试呈阳性反应。

*聚合酶链式反应所发出的荧光随着循环次数增加的改变。红线标示着门坎的水平。(美国疾病控制与预防中心 --- 病毒检测指南)

我们在文中介绍了美国疾病控制与预防中心的第一代检测方法，现时科学界已经研发了一些灵敏度更优胜的新检测试剂（例如：SYBR® Green探针）。

5. 对照实验

新冠病毒测试的可靠性十分重要。毕竟没有人会愿意被错误为确诊者（即假阳性）。另一方面，如果受感染的人被误作阴性（即假阴性），这亦会对社会大众构成风险。

上述的逆转录—聚合酶链式反应并非百分百准确，而当中的每一个步骤都有可能出错。为防任何出错，我们必须在新冠病毒测试之中加入一系列对照实验。

测试的第一步是从病人身上取得核酸样本。为了确认这一步是否妥善完成，测试剂中一般还会包括一个正常人的样本以作对照。如果病人和正常人的样本都对一个人类普遍拥有的基因 (核糖核酸酶P)呈阳性，这代表我们已经成功提取病人的核酸样本。

另外，测试剂中亦包括新冠病毒的核酸样本，以作为阳性对照。这些来自新冠病毒的阳性对照必须被测出对新冠病毒呈阳性，以确保聚合酶链式反应没有出错。此外，整套测试亦会在没有样本的情况下进行，以作为阴性对照。在正常的情况下，阴性对照应该在所有测试都对新冠病毒呈阴性。

如果要肯定一个人确诊新冠肺炎，那个人的样本必须要对新冠病毒三段基因序列呈阳性反应。另外，所有对照实验的结果都必须要与预期中的一致。

大家千万不要忘记辛勤工作、为我们提供可靠检测的化验室人员! 笔者亦在此希望大家能够对他们给予感谢和鼓励! 如果你感到不适并出现新冠肺炎的病征，哪怕病征轻微，你亦应尽快到私家或公营诊所安排检测!